病毒的生(shēng)長和複制需要依存于活體生(shēng)物(wù)或者是生(shēng)物(wù)的組織與細胞；用于體外(wài)培養病毒的細胞統稱爲細胞基質（cell matrix）。細胞培養是指離體的細胞在特定的條件下(xià)在體外(wài)進行生(shēng)長、分(fēn)裂繁殖的過程。

目前，可以用于疫苗等生(shēng)物(wù)制品的細胞基質有多種細胞，例如各種動物(wù)的原代細胞、二倍體細胞、傳代細胞。根據細胞生(shēng)長的模式和要求又(yòu)可以劃分(fēn)爲兩種細胞生(shēng)長類型，即貼壁依賴細胞（anchorage-dependent）和非貼壁依賴細胞（anchorage- independent）。

二倍體細胞是貼壁依賴、接觸抑制生(shēng)長的，有些細胞則是貼壁依賴、接觸促進生(shēng)長的，可以快速形成緻密單層，甚至是多層。

用于制造病毒性疫苗的細胞類型有原代細胞、二倍體細胞、傳代細胞。研究人員可以根據實際需要和自身的條件選取某一(yī)類型的細胞開展疫苗的研究開發工(gōng)作條件選取某一(yī)類型的細胞開展疫苗的研究開發工(gōng)作。

将新鮮動物(wù)組織剪碎、消化、分(fēn)散後，在适當條件下(xià)進行培養的細胞稱爲原代細胞，它們不能進行多代次的長期無限的培養，經過一(yī)定代次培養後，該細胞再也不能生(shēng)長繁殖，直到衰老死亡和凋亡。一(yī)般将動物(wù)組織消化培養的第一(yī)代細胞稱爲原代細胞，第二代細胞稱爲次代細胞，如此類推。

根據不同動物(wù)組織來源，有地鼠腎細胞、沙鼠腎細胞、牛腎細胞、雞胚成纖維細胞等。

如果來源于無特定病原體（SPF）動物(wù)，細胞受外(wài)源因子污染的概率較低，一(yī)般不存在緻癌基因和緻癌蛋白(bái)，故緻腫瘤源性的可能性極低。

可用于減毒活疫苗和滅活疫苗生(shēng)産。迄今爲止，在我(wǒ)(wǒ)國已經批準生(shēng)産的疫苗如下(xià)：

二倍體細胞是指那些能夠在一(yī)定細胞周期即一(yī)定代次範圍内進行有限傳代培養的細胞系；一(yī)般情況下(xià)最多隻能傳代培養50～100代。因爲它們的細胞核的染色體在一(yī)定代次數内仍然是二倍數的，故而得名二倍體細胞。而且，它們的細胞結構仍然與來源生(shēng)物(wù)供體的細胞有一(yī)緻性。在正常情況下(xià)，它們的生(shēng)命周期有限，因此，它是一(yī)種半傳代細胞。

二倍體細胞又(yòu)可以分(fēn)爲人類二倍體細胞和動物(wù)二倍體細胞。

人二倍體細胞（HDCs）是指那些來源于正常人體組織并且能在體外(wài)進行培養的細胞。一(yī)般來源于人類胚胎的肺、腎等組織，其染色體數目與原供體細胞染色體相同或基本相同，2n細胞占80%以上。

目前全球用于疫苗生(shēng)産制備的二倍體細胞有幾個細胞株，在國外(wài)建立并且得到批準用于疫苗生(shēng)産的二倍體細胞有人類二倍體細胞WI- 38、MRC- 5、猕猴胚胎肺二倍體細胞FRhL- 2。我(wǒ)(wǒ)國人二倍體細胞有2BS和KMB17。

二倍體細胞雖然比其他傳代細胞具有更佳的安全性，許多疫苗都以二倍體細胞培養的疫苗作爲金标準。但是，由于它們分(fēn)裂生(shēng)長速度慢(màn)，對于某些病毒不甚敏感，對某些病毒的培養感染滴度或産量明顯低于其他細胞。例如，MRC- 5細胞培養流感病毒冷适應株A/Ann/Arbor/6/60的産量就比用原代雞腎細胞和原代雞胚腎細胞培養低100倍。另外(wài)，一(yī)般認爲，二倍體細胞難以适應柱型攪拌式生(shēng)物(wù)反應器培養。

可用于減毒活疫苗和滅活疫苗生(shēng)産。

在國外(wài)使用的人二倍體細胞系有MRC- 5、WI- 38細胞。在國内建立并且得到批準用于疫苗生(shēng)産的二倍體細胞有2BS、KMB17細胞。

下(xià)面詳細介紹一(yī)下(xià)這幾種細胞， 分(fēn)國外(wài)和國内兩大(dà)類介紹。

（1）國外(wài)的人二倍體細胞系

1）WI- 38人二倍體細胞系

WI- 38細胞由美國Wistar研究所（Wistar institute）的L. Hayflick和他的同事所建立的，故名爲WI-38，是世界上第一(yī)個建株的正常人二倍體細胞，也是首株用于人類疫苗制備的人二倍體細胞系。于1962年7月來源于因治療流産3月齡胚胎，由胰酶消化人胚胎肺組織（human embryonic lung）建立原代細胞，細胞形态爲纖維母細胞樣或成纖維細胞，2n=46，染色體組型（karyotype）是46，XX，正常女性二倍體，G6PD同工(gōng)酶爲B型；它的有限生(shēng)命周期爲50～60代。胸苷标記指數（thymidine labelling index）爲86%。

Hayflick是第一(yī)個建立正常人二倍體細胞的研究者，他于1961年發表了有關該細胞保存方法的論文，當時他将此細胞用于人類衰老的研究。正是利用這種能夠連續傳代的正常人類細胞株，Hayflick制造了第一(yī)個口服脊髓灰質炎病疫苗。

随後，WI- 38細胞被用于生(shēng)産風疹、麻疹、水痘、狂犬病、腮腺炎、甲型肝炎等疫苗。有超過10億的疫苗受者接受過以WI- 38細胞培養制造的疫苗。由于某種原因，目前WI- 38細胞基本被MRC- 5細胞所代替。

2）MRC- 5細胞

MRC- 5細胞來源于人胚肺（human fetal lung fibroblast），MRC- 5細胞系于1966年9月從27歲孕婦因精神病而流産的14周齡胚胎建立起來的，細胞形态爲纖維母細胞樣，染色體組型是46，XY，正常男性二倍體，G6PD同工(gōng)酶爲B型；它的有限生(shēng)命周期爲42～48代，2n=46，占70%，多倍體細胞占3. 6%。

目前，此細胞系已被用于許多減毒活疫苗的生(shēng)産，例如水痘疫苗、風疹疫苗等，以及滅活疫苗如狂犬病疫苗。ATCC編号爲No. CCL- 171

（2）我(wǒ)(wǒ)國的人二倍體細胞

1）2BS

2BS是由北(běi)京生(shēng)物(wù)制品研究所于1973年11月開始建立的一(yī)株人二倍體細胞。此細胞株原始材料來源于由醫院婦産科提供的一(yī)女性胎兒，3月胎齡，系第一(yī)胎。母親23歲，雙親身體健康，家族中(zhōng)無腫瘤及遺傳性疾病史。

該細胞株以1∶2比例分(fēn)傳，在體外(wài)培養曆經8個月，共傳66代。1∶2比例分(fēn)傳時，3～4天形成緻密單層；1∶4比例分(fēn)傳時，則需6～7天。20～40代時，細胞形态好，分(fēn)裂旺盛；至50代時，單位培養面積的細胞産量相繼有所降低；60代以後，衰老期細胞數量不穩定，單位培養面積的細胞産量急劇下(xià)降，以緻66代時，分(fēn)裂終止，細胞死亡。研究者認爲35代前适合用于疫苗生(shēng)産。整二倍體細胞占86. 5%。基礎培養基爲BME。

2）KMB17

KMB17是由中(zhōng)國醫學科學院醫學生(shēng)物(wù)學研究所于1973年10月開始建立的一(yī)株人二倍體細胞。此細胞株原始材料來源于由雲南(nán)省第一(yī)人民醫院婦産科提供的一(yī)女性胎兒，4月胎齡，屬第二胎，爲計劃生(shēng)育關系要求終止妊娠，經水囊引産。母親20歲，父母雙方身體健康，三代直系親屬中(zhōng)無腫瘤及遺傳性疾病史。

該細胞株以1∶2比例分(fēn)傳，在體外(wài)培養曆經9個月零5天，共傳67代（約合70次細胞群體分(fēn)裂）。3～40代時，細胞形态好，分(fēn)裂旺盛；41～60代期間，形态未見明顯差異，單位培養面積的細胞産量相繼有所降低；61代以後，細胞明顯衰老，形成單層時間逐代延長，單位培養面積的細胞産量急劇下(xià)降，以緻67代時，分(fēn)裂終止，細胞死亡。傳代到3代時，作爲原始細胞庫；傳代到6代時，作爲主細胞庫。

染色體檢查證明，人二倍體細胞KMB17在整個傳代過程中(zhōng)始終保持人二倍體細胞的特性。對凍存細胞檢測未發現細菌、真菌、支原體及潛在病毒因子污染。KMB17細胞經10年凍存後其生(shēng)物(wù)學性狀無明顯變化。整二倍體細胞占88. 3%。基礎培養基爲MEM。

1977年，在衛生(shēng)部的領導下(xià)，由協作組對當時國内的3個細胞株進行了全面會同檢定。結果表明，人二倍體細胞2BS和KMB17來源及曆史清楚，早代有大(dà)量細胞種子凍存，傳代壽命分(fēn)别爲63～66代、62～67代。對5個非連續代次檢查均未發現細菌、真菌、支原體污染。通過細胞直接觀察、細胞培養檢查、動物(wù)實驗檢查、包涵體、乙肝表面抗原及電鏡共6個方面多次檢查，未發現潛在病毒因子污染。用抗胸腺細胞血清緻敏小(xiǎo)鼠（或乳鼠）進行緻癌性檢查，未發現移植瘤。對8株病毒的敏感性試驗初步表明，2BS和KMB17對病毒有較廣譜的敏感性。

根據1971年國際占松會議及國内1975年制定的《制備疫苗的人二倍體細胞株暫行管理辦法》有關标準，2BS和KMB17胞核學各項檢查結果均符合要求。經衛生(shēng)部批準，2BS和KMB17人二倍體細胞株可用于疫苗研制和生(shēng)産。2BS和KMB17也符合2000年版《中(zhōng)國生(shēng)物(wù)制品規程》一(yī)部“人二倍體細胞建株、檢定及制備疫苗規程”規定，可用于疫苗生(shēng)産。

2BS和KMB17已經用于脊髓灰質炎減毒活疫苗、風疹活疫苗，同時還用于H2甲型肝炎減毒活疫苗、呂-8株甲型肝炎滅活疫苗的制備。

傳代細胞是指那些能夠無限分(fēn)裂繁殖傳代培養的細胞系；傳代細胞系的染色體是不正常的非整倍體，大(dà)多爲亞二倍體（hypodiploid），有個别細胞經過多代次培養傳代之後，甚至呈多倍體。有些細胞使用不同的培養方法和培養基經過多代次培養傳代之後，可以分(fēn)化成爲許多亞系，在亞系之間的生(shēng)物(wù)學性狀有所差異。根據細胞的來源和本質又(yòu)可以劃分(fēn)爲兩種細胞類型：轉化性細胞和腫瘤源細胞。後者直接來源于腫瘤組織，一(yī)般不能用作爲疫苗等生(shēng)物(wù)制品生(shēng)産的細胞基質。現在常用于疫苗生(shēng)産的轉化性細胞，以Vero細胞爲代表，它已經廣泛地用于多種疫苗的生(shēng)産制造。

選用傳代細胞生(shēng)産疫苗時，應該考慮的原則是：

常用于疫苗等生(shēng)物(wù)制品生(shēng)産的傳代細胞有如下(xià)幾種：非洲綠猴腎細胞（African green monkey kidney）之一(yī)的Vero細胞；Madin- Darby犬腎細胞、中(zhōng)國倉鼠卵巢細胞（CHO）、昆蟲細胞Sf- 9。

Vero細胞是一(yī)種非洲綠猴（Cercopithecus aethiops）腎細胞，由日本千葉（Chiba）大(dà)學的Y. Yasumura和Y. Kawakita于1962年3月27日建立細胞系，它的命名是以世界語（Esperanto）綠色腎“Verda Reno”經縮寫而成Vero，實際上，Vero一(yī)詞在世界語裏亦有“真實”之義。

Vero細胞系于1964年6月15日由B. Simizu博士帶到美國的熱帶病毒學實驗室（laboratory of tropical virology）、國立變态反應和傳染病研究所（NIAID）、國立衛生(shēng)研究院（NIH），此細胞的傳代水平是第93代。于第113代傳代水平時，再提交給美國典型培養物(wù)典藏中(zhōng)心（ATCC），在ATCC培養傳至第121代，并且建庫。

Vero細胞系是染色體不正常的非整倍體（aneuploid）細胞系，可以無限期培養生(shēng)長（grow indefinitely in culture）。有60%的細胞中(zhōng)染色體條數在2n=58；ATCC稱它爲亞二倍體（hypodiploid）。它在被免疫抑制的齧齒類動物(wù)體内不形成腫瘤，因而被認爲是“正常的”。

Vero細胞與其他哺乳類動物(wù)細胞不一(yī)樣，屬于Ⅰ型幹擾素缺陷：當Vero細胞被病毒感染時，它不能分(fēn)泌Ⅰ型幹擾素。但是，它們仍然保留着α/β幹擾素的受體，對外(wài)源加入的幹擾素會産生(shēng)應答。我(wǒ)(wǒ)國用于疫苗制備的Vero細胞系染色體條數大(dà)多在2n=56～58。

最早将Vero細胞系引入疫苗生(shēng)産是Merieux研究所（現屬爲Aventis Pasteur），自從20世紀80年代起，該公司利用Vero細胞制造的滅活脊髓灰質炎病疫苗（IPV）、口服脊髓灰質炎病活疫苗、滅活狂犬病疫苗在法國已得到批準生(shēng)産上市。在美國，于1990年批準IPV生(shēng)産上市，此疫苗現正在美國進行廣泛的嬰幼兒基本免疫程序的疫苗接種。

WHO早在1980年就推薦可使用Vero細胞生(shēng)産滅活脊髓灰質炎病疫苗和狂犬病疫苗，後來又(yòu)推薦用于流感病毒疫苗的生(shēng)産。目前，此細胞系還用于多種滅活疫苗的生(shēng)産，例如甲型肝炎疫苗、流行性出血熱疫苗等，以及正在研究開發的EV71疫苗。

現已證明，Vero細胞對許多病毒的感染敏感，如SV-40、SV- 5、麻疹病毒、蟲媒病毒（arboviruses）、呼腸孤病毒（reoviruses）、猴腺病毒（simian adenoviruses）、脊髓灰質炎病毒、流感病毒、副流感病毒（parainfluenza viruses）、呼吸道合胞病毒、痘苗病毒（vaccinia）、輪狀病毒、乙型腦炎病毒以及其他病毒等。

值得一(yī)提的是，隻有1962年分(fēn)離培養的Vero細胞，即ATCC編号爲No. CCL-81的細胞株和WHO、歐洲細胞培養物(wù)收藏中(zhōng)心（ECACCs）編号88020401細胞株才是用于生(shēng)物(wù)制品疫苗生(shēng)産的細胞基質。Vero E6難以培養，形成單層的時間長，不适用于生(shēng)物(wù)制品生(shēng)産的細胞基質，它的ATCC編号爲CRL-1586；Vero E6細胞是從Vero 76分(fēn)離的克隆株，而Vero 76細胞是于1968年從Vero細胞再分(fēn)離的克隆株，它的ATCC編号爲CRL-1587。

Vero細胞還有許多其他用途，例如，可以利用它篩選和鑒定埃氏大(dà)腸杆菌（Escherichia coli）、志(zhì)賀菌毒素，以及類毒素的檢測等。還用于多種病毒滅活效果的驗證試驗。

中(zhōng)國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）是1957年由T. T. Puck從一(yī)隻成年中(zhōng)國倉鼠卵巢組織進行細胞培養而獲建株的。呈上皮樣貼壁生(shēng)長，貼壁強度适中(zhōng)，核型爲亞二倍體，2n = 22。目前，已有多個突變衍生(shēng)株。

CHO被廣泛使用于實驗室的K1亞克隆株需要脯氨酸，因爲遺傳學上有缺陷，不能将谷氨酸轉變爲谷氨酸-γ-半醛。該細胞是上皮樣細胞，它的特點是通常貼壁生(shēng)長，也可懸浮生(shēng)長，生(shēng)長繁殖速度快。消化傳代可以1∶3～1∶10分(fēn)傳。對于剪切力和滲透壓有較高的忍受能力。它與大(dà)腸杆菌相比，優點在于表達的蛋白(bái)質産物(wù)能進行翻譯後糖基化修飾。

CHO細胞被廣泛地用來表達重組DNA的蛋白(bái)。我(wǒ)(wǒ)國已成功地利用CHO細胞構建表達HBsAg的工(gōng)程細胞生(shēng)産乙型肝炎疫苗，此CHO是經過誘導突變的，不同于CHO- k1，是缺失二氫葉酸還原酶的細胞株（CHO- dhfr-）。CHO- k1細胞株的ATCC編号是No. CCL-61。目前，CHO細胞僅以基因工(gōng)程細胞株用于疫苗和抗體的制備，而不是作爲傳統意義的病毒感染的細胞基質。

Madin- Darby犬腎細胞（Madin- Darby canine kidney，MDCK）是由SH Madin和NB Darby于1958年8月取自外(wài)觀健康的英國成年小(xiǎo)獵犬（Cocker spaniel）腎培養建株，呈吸附生(shēng)長的上皮細胞樣細胞。染色體組核型（karyotype）2n= 78；ATCC認爲它有0. 2%的細胞呈多倍體（polyploidy）。它能分(fēn)泌Ⅰ型幹擾素，而且糖基化譜也與Vero細胞不同。免疫酶染色法顯示，該細胞呈角質蛋白(bái)陽性。

經過長期的傳代培養之後，有人通過比較已發表的文獻發現，不同的MDCK細胞有很多差異。有證據表明，培養基成分(fēn)可以影響MDCK細胞是否具有緻腫瘤性，尤其是無血清培養基。

歐洲已經批準該細胞用于生(shēng)産流感疫苗，目前，此細胞系僅用于滅活流行性感冒病毒疫苗的生(shēng)産，也是唯一(yī)的使用用途。用于疫苗生(shēng)産的MDCK細胞株應是ATCC編号爲MDCK CCL- 34（NBL- 2），歐洲細胞培養物(wù)收藏中(zhōng)心（ECACCs）編号爲MDCK 841211903和MDCK 33016的細胞系。

與雞胚相比，MDCK 33016株培養流感病毒，其HA的産量比雞胚高2～10倍。而且不會造成子代病毒的變異。有人曾經用MDCK細胞和雞胚從臨床樣品中(zhōng)間分(fēn)離培養H3N2流感病毒進行比較，發現利用MDCK分(fēn)離培養的H3N2流感病毒，其HA的抗原性和結構都沒有發生(shēng)變化，利用雞胚分(fēn)離培養的H3N2流感病毒出現了結構和抗原性3個亞群體（sub- population）的差異，主要表現在HA1的氨基酸序列上。

MDCK細胞可以感染人柯薩奇病毒（Coxsackie virus）B3、B4、B5，2型人脊髓灰質炎病毒，呼腸孤病毒（reovirus）2型，痘病毒，腺病毒，腺病毒相關病毒（adeno- associated virus）4、5型，印度株VSV，傳染性犬肝炎病毒等。

它是草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢細胞株IPLB- Sf- 9。早在1977年由美國Henry A. Wallace Beltsville農業研究中(zhōng)心建立的IPLB- SF 21 AE，德州A＆M大(dà)學G. E. Smith和C. L. Cherry于1983年再從細胞株IPLB- SF 21 AE亞克隆得到一(yī)個細胞株IPLB- Sf- 9。

它是上皮細胞，生(shēng)長繁殖速度快，對外(wài)界環境适應性強，既可貼壁又(yòu)可懸浮生(shēng)長培養，培養溫度可低至27℃，生(shēng)長pH 6. 0～6. 4，能耐受的滲透壓範圍爲340～390mOsm/kg，比一(yī)般的哺乳類動物(wù)細胞高。容易适應無血清培養，如無血清培養基SF- 900Ⅱ。

現在利用Sf- 9細胞培養病毒，尤其是杆狀病毒（baculovirus），用于生(shēng)産重組蛋白(bái)，通常的表述都是Sf- 9細胞/杆狀病毒系統，此時，細胞/杆狀病毒系統多表示爲重組型的杆狀病毒。利用Sf- 9細胞/杆狀病毒系統，國外(wài)一(yī)家公司已經成功研究開發了人乳頭瘤病毒VLP疫苗。早期，我(wǒ)(wǒ)國的研究人員曾經利用Sf- 9細胞作爲制備乙腦疫苗生(shēng)産用細胞基質進行了研究探索。

昆蟲細胞系有Sf- 9、Hi- 5，緻瘤性細胞系（tumorigenic cell lines）包括有人源細胞系PER. C6、293細胞和犬類MDCK細胞。目前，其中(zhōng)有些已經在個别國家取得生(shēng)産批準。但是，美國FDA對于這些細胞仍存疑慮，美國FDA所屬的生(shēng)物(wù)制品評價中(zhōng)心（CBEA）把它們列入需要進一(yī)步研究考察的細胞基質。

目前，正在研究的熱點傳代細胞有PER. C6，由荷蘭Leiden大(dà)學的Fallaux、F. J.等人于1996年建株，來源于視網膜細胞，他們建立PER. C6細胞株的原本目的是用作腺病毒5型培養的工(gōng)程輔助細胞，第5型腺病毒是用于基因治療的基因表達載體。Fallaux、F. J.等人于1998年發表PER. C6細胞建株的論文，後來有人将此細胞用于培養流感病毒，并且獲得成功，得到世人的矚目，國外(wài)已有跨國集團出巨資購買和資助研究PER. C6細胞株用作爲病毒性疫苗生(shēng)産的細胞基質。

PER. C6細胞株起源于18周齡人胚胎視網膜細胞（human embryonic retina cells），初期培養的人胚胎視網膜母細胞（human embryonic retinoblast，HER）稱爲911細胞，利用含有第5型腺病毒E1A. E1B基因的質粒pIG. E1A. E1B轉染911細胞，根據轉染的染色體位點不同，他們建立了7個細胞系，把含有并且能夠表達E1A. E1B蛋白(bái)質的細胞系統稱爲PER細胞，PER. C6細胞就是其中(zhōng)之一(yī)。因此，PER. C6細胞又(yòu)被稱爲“被設計”的細胞系（designer cell line）。

PER. C6細胞帶有第5型腺病毒基因組459～3510堿基序列（E1A. E1B基因），E1A. E1B基因是由人磷酸甘油酸酯激酶（phosphoglycerate kinase，PGK）啓動子調控的。Fallaux等人證明，即使以複制缺陷型腺病毒感染PER. C6細胞，PER. C6細胞也不會産生(shēng)有複制能力的腺病毒（replication- competent adenoviruses，RCAs）。細胞尺寸大(dà)小(xiǎo)在低代次時爲17. 7μm、在高代次的對數生(shēng)長期爲～18.5μm。

利用PER. C6細胞培養流感病毒，其培養時間和病毒濃度都可與雞胚培養技術相比；病毒産量可提高10倍。PER. C6細胞的典型培養液是含10%胎牛血清的DMEM，條件是5% CO₂和濕溫37℃。

對于理想的疫苗用細胞基質而言，新細胞系應可傳代，且具已知(zhī)轉化條件和背景，在人類體内使用是安全的，培養條件不苛刻，具有非貼壁依賴生(shēng)長及在無血清細胞條件下(xià)培養能力，分(fēn)裂生(shēng)長速度快，對于大(dà)部分(fēn)病毒敏感，病毒培養的感染滴度或産量明顯高于其他細胞。目前，沒有理想化的十全十美細胞，各自都有自身的優點和缺陷，研究者可以根據本身的條件及目的病毒的特性選取細胞系。

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