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間充質(zhì)幹細胞（MSCs）是一種多(duō)能(néng)幹細胞，可(kě)從多(duō)種組織來源中(zhōng)分(fēn)離得到，最常見的為(wèi)骨髓、脂肪組織和臍帶。MSCs具(jù)有(yǒu)自我更新(xīn)能(néng)力，并可(kě)被誘導分(fēn)化為(wèi)脂肪、軟骨、骨、肝、肌腱和心肌等多(duō)種類型的細胞。MSCs可(kě)通過抑制T細胞和淋巴細胞增殖等機制調節免疫反應[1, 2]。此外，MSCs還具(jù)有(yǒu)抗氧化、抗凋亡、抗纖維化和促血管生成的特性[8]。因此，MSCs在免疫調節和組織再生方面具(jù)有(yǒu)顯著的臨床潛力。事實上，MSCs已在許多(duō)臨床試驗中(zhōng)用(yòng)于免疫介導疾病和組織損傷的治療。已使用(yòng)MSCs治療的疾病包括肝病、周圍神經損傷、移植物(wù)抗宿主病、自身免疫性疾病、糖尿病和心髒病[3, 4]。2024年12月18日，美國(guó)食品藥品監督管理(lǐ)局（FDA）批準Ryoncil（remestemcel-L-rknd）上市，這是一種異體(tǐ)間充質(zhì)基細胞療法（mesenchymal stromal cell，MSC），用(yòng)于治療對類固醇無反應的急性移植物(wù)抗宿主病（SR-aGVHD），适用(yòng)于年齡為(wèi)2個月及以上的兒科(kē)患者。
臨床需求
MSCs在治療應用(yòng)中(zhōng)的一個關鍵限制是其在所有(yǒu)組織中(zhōng)的數量都很(hěn)少，且分(fēn)離得到的MSCs數量不足以滿足臨床需求。通常給予患者的劑量為(wèi)2 × 106 cells/kg體(tǐ)重[1, 2]。對于某些患者和疾病，為(wèi)達到所需的治療效果，需要多(duō)次給予多(duō)達數億個MSCs[5, 6]。雖然傳統的細胞培養皿和培養瓶在體(tǐ)外擴增MSCs，也可(kě)以獲得實驗級别足夠細胞數量，但對于臨床用(yòng)途而言遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。如使用(yòng)細胞培養瓶進行大規模細胞擴增時，需要更多(duō)的人力和培養空間。此外，使用(yòng)細胞培養瓶進行大規模擴增不僅效率低下，而且還會影響細胞質(zhì)量，因為(wèi)長(cháng)期在體(tǐ)外擴增的MSCs可(kě)能(néng)會失去其幹細胞特性[7]。既往研究還報告稱，當MSCs達到較高的傳代次數時，其增殖和分(fēn)化潛力會降低[8]。因此，确定一種有(yǒu)效的大規模擴增技(jì )術對于在短時間内以具(jù)有(yǒu)成本效益的方式獲得大量細胞，同時不損害細胞質(zhì)量而言至關重要。
常見規模化擴增工(gōng)藝
目前MSCs的大規模擴增主要有(yǒu)4種策略，即多(duō)層細胞工(gōng)廠、轉瓶（spinner）、滾瓶（roller bottle）和生物(wù)反應器。四種方法各有(yǒu)優劣。
*本文(wén)中(zhōng)的2D培養指細胞貼附在培養容器表面培養，3D培養指在多(duō)孔微載體(tǐ)上培養，而在實心微載體(tǐ)表面培養則被認為(wèi)是介于2D和3D之間。
工(gōng)藝選擇的主要考量點
✦ 生産(chǎn)效率和成本：轉瓶和滾瓶可(kě)以被視作(zuò)簡化版的迷你生物(wù)反應器，但和多(duō)層細胞工(gōng)廠一樣，都需要大量的人工(gōng)操作(zuò)，而且比細胞工(gōng)廠占用(yòng)更多(duō)的場地。生物(wù)反應器則能(néng)實現自動化3D培養，占據的車(chē)間面積大大減少。
✦ 生産(chǎn)效率和成本：轉瓶和滾瓶可(kě)以被視作(zuò)簡化版的迷你生物(wù)反應器，但和多(duō)層細胞工(gōng)廠一樣，都需要大量的人工(gōng)操作(zuò)，而且比細胞工(gōng)廠占用(yòng)更多(duō)的場地。生物(wù)反應器則能(néng)實現自動化3D培養，占據的車(chē)間面積大大減少。
✦ 規模和難度：較小(xiǎo)的培養容器僅适合于擴增自體(tǐ)回輸用(yòng)MSCs，而不足以滿足每批生産(chǎn)可(kě)産(chǎn)生多(duō)人份的異體(tǐ)治療劑量需求。生物(wù)反應器因其可(kě)控的培養環境，更利于大規模MSCs的擴增，而不會影響細胞活力、表面标記物(wù)表達和分(fēn)化潛力。但操作(zuò)起來技(jì )術門檻較高，需要技(jì )術人員具(jù)備一定經驗。
✦ 表面marker：生物(wù)反應器擴增後CD105的陽性表達率降至95%以下（BM-MSCs為(wèi)88%，AT-MSCs為(wèi)92%）[9]。其他(tā)幾項研究也報道了使用(yòng)生物(wù)反應器和轉瓶擴增的MSCs上CD90和CD105的表達減少[10,11]。作(zuò)者推測，這可(kě)能(néng)是由于剪切力或消化過程引起的細胞損傷。據報道，與CD105+ MSCs相比，CD105- MSCs更容易分(fēn)化為(wèi)脂肪細胞和骨細胞，并且更有(yǒu)效地抑制CD4+ T細胞的增殖，但心髒再生潛力卻更差。CD90- MSCs與較弱的免疫抑制活性和增強的成骨和脂肪基因分(fēn)化有(yǒu)關[12,13]。因此，在生物(wù)反應器和轉瓶擴增後CD90和CD105表達的缺失可(kě)能(néng)會增強MSCs治療癌症某些疾病的效力。
✦ 擴增倍數：根據Hassan等人的統計分(fēn)析，目前所報道的生物(wù)反應器和細胞工(gōng)廠的擴增倍數要比轉瓶和滾瓶要高。對于細胞工(gōng)廠，不同研究的擴增倍數比差異很(hěn)大，一些研究報告的擴增倍數低于20倍，但有(yǒu)少數研究報告的擴增倍數超過100倍，可(kě)能(néng)是種子初始密度較低所緻[1]。
使用(yòng)不同的生物(wù)工(gōng)藝獲得的擴增率[14]
賽科(kē)成MSCs大規模培養方案：
賽科(kē)成在貼壁細胞培養方面有(yǒu)多(duō)年經驗積累，在内部測試及客戶現場均獲得了良好的結果。市面上微載體(tǐ)一般分(fēn)為(wèi)可(kě)降解與不可(kě)降解兩種。針對這兩種不同工(gōng)藝，賽科(kē)成均有(yǒu)對應的全套解決方案。
工(gōng)藝路線(xiàn)1：适用(yòng)于可(kě)降解型球狀微載體(tǐ)
細胞可(kě)降解型球狀微載體(tǐ)表面及孔洞内部進行，是一種更接近于天然組織中(zhōng)3D培養的模式。對MSCs進行擴增，可(kě)以配合賽科(kē)成玻璃罐體(tǐ)反應器或一次性攪拌式反應器進行擴增，在反應器内完成細胞的貼壁、培養和微載體(tǐ)酶解步驟，并支持逐級放大，最多(duō)可(kě)以放大至三級，單批次生産(chǎn)百億量級MSCs。
工(gōng)藝路線(xiàn)2：适用(yòng)于不可(kě)降解型2D微載體(tǐ)
MSCs在不降解型2D微載體(tǐ)表面進行擴增，是一種介于2D和3D之間的培養方式，擴增完成後需要用(yòng)重組胰酶等消化液進行消化，才能(néng)進行細胞的收獲或進一步放大培養。可(kě)以配合賽科(kē)成玻璃罐體(tǐ)反應器或一次性攪拌式反應器進行擴增，在反應器内完成細胞的貼壁和培養，然後轉移到專有(yǒu)的微載體(tǐ)消化清洗罐内進行消化和清洗。同樣支持逐級放大，最多(duō)可(kě)以放大至三級，單批次生産(chǎn)百億量級MSCs。
賽科(kē)成生物(wù)反應器
賽科(kē)成有(yǒu)多(duō)種型号規格的生物(wù)反應器，并可(kě)以提供相應技(jì )術方案，支持MSCs培養中(zhōng)培養基、微載體(tǐ)的篩選及工(gōng)藝優化，小(xiǎo)試至大規模擴增工(gōng)藝全流程。
參考文(wén)獻：
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[14] Hassan, M. N. F. B. , Yazid, M. D. , Yunus, M. H. M. , Chowdhury, S. R. , & Law, J. X. . (2020). Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells. Stem Cells International, 2020(1), 1-17.
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