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武漢賽科成科技有限公司

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    基于武漢賽科成SKC300生(shēng)物(wù)反應器無血清培養間充質幹細胞
    發布日期：2023.07.28

    幹細胞作爲一(yī)種能夠自我(wǒ)(wǒ)更新和分(fēn)化的細胞類型，自被發現起，幹細胞就一(yī)直是研究熱點。間充質幹細胞（mesenchymal stem cells, MSC）是成體幹細胞家族的重要成員，來源于發育早期的中(zhōng)胚層和外(wài)胚層。MSC最初在骨髓中(zhōng)發現，後期研究發現MSC廣泛存在于人體的許多種組織中(zhōng)。MSC具有多向分(fēn)化潛能、造血支持和促進幹細胞植入、免疫調控和自我(wǒ)(wǒ)複制等特點。如MSC在體内或體外(wài)特定的誘導條件下(xià)，具有向成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞、骨髓基質和心肌細胞分(fēn)化能力，不僅如此，它還可以跨胚層分(fēn)化爲神經細胞、肝髒細胞、胰島細胞等。經連續傳代培養和冷凍保存後仍具有多向分(fēn)化潛能，可作爲理想的工(gōng)具細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修複。

    MSC已成臨床研究與應用的熱點。截止2021年4月，在ClinicalTrials.gov網站檢索到的間充質幹細胞臨床試驗超過1200個。近年來，這個數字持續增長，表明間充質幹細胞的重要性日益增強。據不完全統計，全球曾經獲準上市的間充質幹細胞産品有18款，符合藥品定義的有10款。目前，我(wǒ)(wǒ)國的幹細胞藥物(wù)研發愈發規範，吸引大(dà)量資本和人才進入。

    全球幹細胞療法大(dà)多處在技術到産品轉化的階段。在體外(wài)進行細胞規模化的高效擴增MSC，是應用和轉化的關鍵。本研究基于微載體，利用賽科成SKC300生(shēng)物(wù)反應器無血清培養間充質幹細胞，結果證實具有良好的應用前景。

    01 

    實 驗 材 料

    細胞：間充質幹細胞

    培養方式：微載體Cytodex 1貼壁培養

    培養基：幹細胞培養基

    反應器：賽科成SKC300生(shēng)物(wù)反應器-7.5L

    SKC300+攪拌槳.jpg

    圖1 賽科成SKC300生(shēng)物(wù)反應器及攪拌槳


    02 


    實 驗 步 驟

    1. 微載體預處理 

    1.1微載體處理：Cytodex1使用DPBS溶脹3h。

    1.2使用DPBS洗滌2次Cytodex1，DPBS浸泡後滅菌（121℃，30min）。

    1.3 Cytodex1瓶内棄上清，瓶内無血清培養基洗滌2次。

    2. 賽科成SKC300生(shēng)物(wù)反應器的操作 

    2.1 使用前極化pH,DO電極6小(xiǎo)時，校準pH電極。

    2.2 SKC300罐體121℃滅菌1小(xiǎo)時後，與控制系統連接好。将培養液從儲液袋加入到罐體内。

    2.3 無菌實驗。轉速：40-60rpm，pH：7.4，DO：50%，流量0.2L/min，三氣體或四氣體模式。

    3. MSC細胞培養及接種過程 


    3.1 按6000cells/cm2接種新鮮MSC細胞至微載體培養液中(zhōng)，将微載體和細胞的混合懸液一(yī)起加入到罐體中(zhōng)。

    3.2 培養參數轉速：40-60rpm，pH：7.4，DO：50%，流量0.2L/min，三氣體模式。

    3.3 每天從罐内無菌取樣口用無菌注射器抽取5ml-10ml培養液，進行細胞計數，生(shēng)化，鏡檢，支原體、内毒素等安全性質量檢測。

    3.4 培養4-5天收獲。

    4. MSC細胞的收獲 

    4.1培養4-5天後将罐内微載體懸浮液從罐内轉移至消化袋（消化袋如圖2所示）。

    4.2 直接抽出上清，DPBS洗滌兩遍，加入Tryple消化酶，溫和搖勻消化6min-15min。從取樣口取樣觀察消化情況，當細胞完全與微載體分(fēn)開後，從袋内抽出細胞懸液。加入DPBS洗滌2遍。

    4.3 細胞懸液400×g離心，5min。收集細胞，計數。

    消化袋截圖.png

    圖2 賽科成自主研發生(shēng)産的細胞培養消化袋


    03 



    實 驗 結 果

    ① 細胞生(shēng)長情況

    按6000cells/cm2接種新鮮MSC細胞至微載體，培養4天後細胞在微載體生(shēng)長情況見圖3。

    MSC細胞01.png

    圖3微載體培養MSC

     ② 細胞消化情況

    轉移至消化袋後利用Tryple消化酶，溫和搖勻消化6min-15min，細胞消化狀态如圖4所示。

    MSC細胞02.png

    圖4 細胞消化狀态（消化12min）

     ③ 細胞密度情況

    接種後每天從罐内無菌取樣口用無菌注射器抽取5ml-10ml培養液，進行細胞計數，結果如圖5所示。


    微載體細胞生(shēng)長圖01.png

    圖5A 細胞密度（微載體密度12g/L）

    微載體密度02.png

    圖5B 細胞密度（微載體密度18g/L）


    根據上面的實驗結果，在賽科成SKC300生(shēng)物(wù)反應器培養MSC細胞不僅可以高密度微載體培養，而且具有良好的一(yī)緻性。



    參考文獻

    [1] Y Jiang, Jahagirdar, N Balkrishna,et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.[J]. Nature, 2002.

    [2] 王蓓, 汪維偉. 間充質幹細胞的研究進展[J]. 國外(wài)醫學:外(wài)科學分(fēn)冊, 2005.

    [3] Vallone V, Romaniuk M A, Choi H , et al. Mesenchymal stem cells and their use in therapy: What has been achieved?[J]. Differentiation, 2013.

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